厭氧菌的分離培養(yǎng)主要分初代培養(yǎng)和次代培養(yǎng)兩個階段,其中初代培養(yǎng)相對比較困難,的問題就是厭氧環(huán)境和培養(yǎng)基的選擇。
初代培養(yǎng)的一般原則是:
?。?)先將標本涂片染色直接鏡檢,指導培養(yǎng)基的選擇。
(2)盡量選用在厭氧菌中覆蓋面寬的非選擇性培養(yǎng)基。
?。?)好多選1~2種覆蓋面不同的選擇性培養(yǎng)基。
?。?)盡量保證培養(yǎng)基新鮮。
(5)要考慮到微需氧菌存在的可能。
1.選用適當?shù)呐囵B(yǎng)基接種:應接種固體和液體兩種培養(yǎng)基;
?。?)培養(yǎng)基的使用,應注意下列各點:
1)盡量使用新鮮培養(yǎng)基,2~4h內用完;
2)應使用預還原培養(yǎng)基,預還原24~48h更好;
3)可采用預還原滅菌法制作的培養(yǎng)基(用前于培養(yǎng)基中加入還原劑,如L-半胱氨酸、硫乙醇酸鈉、維生素C及葡萄糖等,盡可能使預還原劑處于還原狀態(tài));
4)液體培養(yǎng)基應煮沸10min,以驅除溶解氧,并迅速冷卻,立即接種;
5)培養(yǎng)厭氧菌的培養(yǎng)基均應營養(yǎng)豐富,并加有還原劑與生長刺激因子(血清、維生素K、氯化血紅素、聚山梨酯-80等)。
?。?)培養(yǎng)基的選擇:初次培養(yǎng)一般都使用選擇培養(yǎng)基和非選擇培養(yǎng)基。
1)非選擇培養(yǎng)基:本培養(yǎng)基使分離的厭氧菌不被抑制,幾乎能培養(yǎng)出所有的厭氧菌。常使用心腦浸液瓊脂(BHI)、布氏瓊脂(BR)、胰豆胨肝粉瓊脂(GAM)、胰胨酵母瓊脂(EG)、CDC厭氧血瓊脂等。
2)選擇培養(yǎng)基:為有目的選擇常見厭氧菌株,以便盡快確定厭氧的種類。
2.每份標本少接種3個血平板,分別置于有氧,無氧及5%~10à2環(huán)境中培養(yǎng),以便正確地培養(yǎng)出病原菌,從而判斷其為需氧菌、兼性厭氧菌、微需氧菌或厭氧菌中的哪一類。
3.厭氧培養(yǎng)法
(1)厭氧罐培養(yǎng)法。
?。?)氣袋法。
?。?)氣體噴射法:又稱轉管法。
?。?)厭氧手套箱培養(yǎng)法:是迄今厭氧菌培養(yǎng)的佳儀器之一。
?。?)其他培養(yǎng)法:平板焦性沒食子酸法醫(yī)學教育網搜集|整理;生物耗氧法;高層瓊脂培養(yǎng)法。
4.厭氧狀態(tài)的指示:美藍和刃天青。無氧時均呈白色,有氧時美藍呈藍色,刃天青呈粉紅色。
5.分離培養(yǎng)厭氧菌失敗的原因:①培養(yǎng)前未直接涂片和染色鏡檢;②標本在空氣中放置太久或接種的操作時間過長;③未用新鮮配制的培養(yǎng)基;④未用選擇培養(yǎng)基;⑤培養(yǎng)基未加必要的補充物質;⑥初代培養(yǎng)應用了硫乙醇酸鈉作為厭氧菌培養(yǎng)基;⑦無合適的厭氧罐或厭氧裝置漏氣;⑧催化劑失活;⑨培養(yǎng)時間不足;⑩厭氧菌的鑒定材料有問題。